Reprise du message précédent :

 
Ils ont malheureusement fait bien pire !
 
Lire le clash dans cette même revue entre Courtillaud et Bard... Sûrement évoqué dans ce topic d'ailleurs. Si cela pouvait mettre un terme à tout un tas de pratiques douteuses dans le monde de l'édition scientifique !
 
Edit : Oups, je viens de relire le titre du topic et je suis HS.  

Bonjour à tous,  
je suis étudiante en sciences de vivant et ayant mes examens prochainement, je suis évidemment en pleine révisions.
En essayant de faire un exercice de biochimie dans les annales, je rencontre qq problèmes:
il s'agit d'un exercice sur les acides nucléiques : un gène d'interêt a été cloné dans un plasmide ( ce dernier fait 2700 paires de bases)
Nous avons d'une part une représentation du gène qui fait 1400 paires de bases ( extrémité 5 ' : SmaI ; extrémité 3' HindIII ), ainsi qu'un schéma du plasmide. Nous disposons également du gel d'agarose de l'analyse de restriction du plasmide recombinant :  
- une première digestion est effectuée par KpnI ( qui se trouve dans la casette de clonage) --> on obtient 2 bandes de 3700 et 400
- une deuxième digestion par NdeI ( qui n'est pas dans la casette de clonage) --> on obtient les meme bandes que précédemment
- enfin une double digestion avec les deux enzymes précédentes -->on obtient une bandes à 3500 et une bande plus épaisse à 200 ( représente probablement 3 fragments)
 
Il faut avec ceci établir une carte de restriction,en placant les différents sites.
N'ayant jms fait d'exercice de ce genre, je ne sais par ou commencer, ni comment procéder ..
En espèrant que vous ayez du temps à m'accorder et en vous remerciant d'avance.  
     

 
lol, on voit que tu n'as pas lu les 205 pages d'idioties qui vont avec alors ^^

Quoi qu'il en soit, mon projet de simulation de sélection naturelle dans le cadre d'un monde constitué de joueurs de go prend forme : ça évolue, lentement mais, je l'espère, sûrement. Je vous invite si vous êtes intéressés à en suivre l'avancement et éventuellement à donner un petit coup de main en terme de calculs numériques à venir en discuter sur le topic que j'ai créé à cet effet : http://forum.hardware.fr/hfr/Setie [...] 6989_1.htm

 
 
Salut à toi collègue et voisine
 
Alors en premier lieu, il faut que tu "construise" le plasmide recombinant en y placant le gène (taille totale 2700+1400 = 4100pb)
Tu place ensuite les sites de clonage du gène de part et d'autre.
Apres, tu sais que KpnI est une enzyme située dans la cassette de clonage. En général les sites de restriction présents dans une cassette de clonage ne sont pas présents une deuxième fois sur le plasmide (sinon ce site n'est plus facilement utilisable pour inserer un gène). Ici le deuxième site KpnI doit donc se situer dans le gène insèré, à 400 pb du premier site (cassette de clonage)
Enfin, tu sais que NdeI coupe lui aussi en deux sites (puisque deux bandes apres la restriction par NdeI) et que conjugé à KpnI, il produit 3 fragments de 200pb (seule possibilité pour retrouver le total de 4100pb). La seule possibilité pour avoir cette combinaison est de couper en son milieu le fragment de 400pb generé par KpnI, et de couper ensuite dans le gène inseré, à 200pb en 3' du site KpnI qui s'y trouve.
 
Je sais pas si c'est super clair dit comme ca, c'est jamais évident quand on a jamais connu les lconages pour de vrai

Fais à la va vite: (faut juste lire l'explication de gandilflegras et regarde mon image )

C'est otujours plus simple de faire des schémas pour piger ce genre de chose!

Voilà. Toujours passer par un schéma. Les bandes font la même taille dans ton cas, ce qui est un peu piège. Il y a juste décalage, donc quand on met les 2, la bande de 400 que tu obtiens à chaque fois est coupée en 2.
 
La solution : faire ce que vient de faire Aragorn Hendrix : représenter ce que peux déduire hypothétiquement de chaque piste.
Après, c'est un puzzle. Comment obtenir une bande de tant.
Place un site Ori, ça aide parfois. OSEF qu'il soit bien placé ou pas. Tu le places juste comme repère. (sinon, sur un rond, dur de trouver un point de départ).

Salut,  
 
une question de noob : la modification génétique, déjà en vigueur sur les plantes et les animaux, sera-t-elle applicable à l'homme, et si oui quand ?  
 
merci

Applicable oui en terme de thérapie génique, c'est à dire insertion d'un gène modifié pour corriger un gène défaillant (genre mucoviscidose).
 
Par contre faire un humain génétiquement modifié avant sa naissance, ça c'est encore bon pour Gattaca! Et ça ne devrait pas arriver en raison des problèmes éthiques que cela engendreraient. (Eugénisme, appauvrissement des génomes, etc...)

Temps de génération trop long chez l'homme,c'est pas demain la veille qu'on verra des lignées humaines transgéniques !

Merci bcq pour vos réponses qui m'ont permit d'éclaircir le sujet!
Toutefois je ne suis pas sur d'avoir compris l'explication pour NdeI : cela veut donc dire que NdeI se trouve 2 fois dans le gène que l’on a inséré? ( on aurait NdeI – KpnI – NdeI sur le gène ? )
NdeI ne peut-il pas se retrouver dans le vecteur, le plasmide en lui meme?
Que représente au juste une casette de clonage? ca reste qq chose d'abstrait pour moi ..
merci!
 

 
Si NdeI se trouvait sur le plasmide d'origine, tu n'arriverais pas a obtenir les combinaisons 3*200 + 3700pb. Faut juste essayer les différentes possibilités compte tenu des positions des sites KpnI, et ici c'est la seule possible.
 
Une cassette de clonage est une zone du plasmide contenant un grand nombre de sites de restriction, souvent rares et uniques, qui peuvent être utilisés aisément pour insérer un gène voulu.

une ptite image la cassette (polylinker restriction site en anglais) est entre les 2 sites I-SceI.

Mon sujet de thèse    

Ahem... Thérapie génique, c'est vite dit hein. La 21 hydroxylase a pas fini de tuer. Le problème, c'est pas d'insérer du génôme dans une cellule, ni de le faire exprimer, c'est de le faire transmettre.
A ce niveau là, il est plus facile technologiquement de faire un embryon modifié, façon Gattaca comme on le disait. Par contre, les obstacles sont plus importants (et amplement justifiés) éthiquement.
Après, on est pas encore au point de savoir ce que chaque mutation, insertion, déletion, cause comme réel effet.
 

En fait, tu as un plasmide, un "conteneur", dont on conserve seulement quelques fonctions, un promoteur. On a cette "cassette de clonage", MLS Multi je c plus koi Site, qui est une séquence assez courte, et comme déjà dit, qui contient de nombreux sites de restriction.
L'idée, c'est d'avoir une seule zone dans laquelle on trafique tranquilement, sans perturber tout le reste.
C'est dans cette cassette qu'on travaille. On va prendre un site qui génère des extremités cohésives, pas des franches. L'avantage, c'est que tu vas insérer ton fragment d'intéret avec des extremités qui correspondent... Donc ton site qui était unique à la base, se retrouve présent à chacune des extrémités de la partie qui t'intéresse. D'où le fait que ça soit archi pratique.
 
Ensuite, faut garder en tête que ton plasmide est circulaire. Tu as inséré ton fragment, a balancé des ligases pour reficeler tout ça, transfecté, laissé quelques cycles à tes bactos ou à ton phage, avant d'aller voir ce que ça donne. Donc ton plasmide est circulaire.
Si tu coupes une fois, tu linéarises, mais tu n'as toujours qu'une bande. Il faut couper deux fois pour avoir deux bandes. Une fois pour linéariser, une fois pour couper cette bande en deux.
D'où le schéma de Aragorn, avec 3bandes de 200pb, vu que chacune de te deux enzymes de restriction coupe en 2 endroits.

_Tchip_ , tu bosses sur la thérapie génique? ou la 21'OH ?

thérapie génique (pour la mucoviscidose)

Ben bon courage...
C'était le domaine de mon prof de biomol... Et ils se bashaient entre la prof d'histo et lui. C'était bien fun.
J'ai même eu mon épreuve de Biomol sur la muco...

Honnetement, il y en a qui aime écrire des papiers ?
C'est sympa la science, mais l'écriture, c'est d'un lourd. Si j'avais voulu passé mes nuits à écrire, j'aurais fait Lettres ou Sciences-Po.

Bah, t'as le premier élan, tu t'imagines faire un PLOS, un Nature, un Science... Communiquer sur ton travail, être reconnu, cité... Puis faut condenser, passer des tas de trucs à la trappe... Être corrigé 12 fois par Dirlo1. Avant que Dirlo te fasse remettre tout ce que Dirlo 1 a viré. Sans parler des articles en colaboration...
Bref, c'est comme tout le reste : une bonne excitation pour les puçals, pour la première fois.... puis ça devient rasant et lourd! A la fois, c'est ton seul critère de notation...

 
Tu n'existes qu'au travers de tes papiers    
 
Perso c'est l'inverse, la paillasse j'en ai plein le cul.

Bah, voilà la différence entre celui qui deviendra chef de labo, puis grand patron, fera des heures, montera à l'ANR, et celui qui restera à la paillasse, fera son taf auprès des stagiaires!

Ouais, mais quand on n'a qu'une maitrise basique de l'anglais, et qu'on n'arrive pas à déblatérer sur des pages autour d'un sujet, ça devient vite une corvée...

C'est pas faux

 
Si tu lis bcp de papiers, ca vient naturellement    
 
C'est la qu'on detecte ceux qu'ont fait semblant de bosser pdt leur these    
 
 
Le 1er est jamais facile, ca ira mieux apres, bon courage  

mouais enfin pour ma part, cela m'a amusé pour le premier, ensuite cela sort vite par les yeux, surtout pour la partie discussion où, quand tu n'as pas 6 ans de recul sur le sujet, t'en chie grave...

L'avantage par la suite, c'est que tu t'auto-cites en pagaille. Pour le premier, faut bien aller lire ce que les autres ont fait...

le soucis, en tant que "jeune chercheur" (pour ma part je commence mon 2e post doc lundi....) tu changes de sujet à chaque fois, donc l'autocitation moyen...  

Faut essayer de bosser dans le même domaine.

bah oui, facile à dire  
Mais un post doc, c'est fait (un peu) pour évoluer, pas faire la même chose qu'en thèse. De plus, tu sais que dans nos domaines super pointus, même si tu t'éloignes que peu, et bah t'es bon pour te refaire toute ta biblio

Ca dépend dans quels domaines on va dire.
La biomol végétale, j'ai de la chance, c'est encore à ses balbutiements, et y'a que Arabidopsis de toute façon ou pas loin.

Insérer un gène dans une cellule, in vitro aucun soucis, mais in vivo, quand tu cherches à insérer ton acide nucléique dans une cellule bien définie, c'est un sacré problème.
 
Tchip pourrait nous donner un petit aperçu des approches envisagées actuellement, mais je suppose, dans le cas de la mucoviscidose, qu'on cherchera dans un premier temps à administrer des gènes sauvages aux cellules pulmonaires et intestinales.
 
Maintenant, comment fait on pour faire reconnaitre aux vecteurs ces cellules en particuliers? quels modes d'administration sont possibles? Les muqueuses, épaisses, doivent former une sacrée barrière pour les vecteurs du gène, non?
 
Ou bien on envoie le tout dans la circulation sanguine et on attend de voir où les vecteurs vont agir?  
 
Quant à savoir où la recombinaison va s'effectuer et le nombre de séquences intégrées...

Je suis curieux

C'est une partie de mon travail qui sera réalisée plus tard  
Pendant ce temps je dois plutôt synthétiser un activateur potentiel de la protéine mutée et inactive.

Bonjour,  
Je profite d’un msg précédent car j’ai un exercice similaire à faire sauf que les deux enzymes se trouvent dans la casette de clonage. Je vous explique :  
On clone un gène dans un plasmide. Puis on digère avec plusieurs enzymes.
Une première digestion avec BamHI (se trouve dans la casette de clonage)qui donne 2 fragments de 4500 et 1000.
Une deuxième ave EcoRI (se trouve également dans la casette) qui donne les mêmes bandes et enfin on effectue une double digestion avec les 2 enzymes précédentes et on obtient 1 bande de 4000 et une seconde qui correspond à 3 bandes de 500.
Comment peut-on alors savoir quelle enzyme coupe l’autre :
Il me semble que l’on peut avoir  EcoRI qui coupe le fragment de 1000 de BamHI en son milieu ou alors l’inverse BamHI qui coupe le fragment de 1000 de EcoRI en son milieu, non ?
On aurait soit  
- EcoRI BamHI EcoRI
- Ou l’inverse BamHI EcoRI BamHI
C’est cela ?
Une 1ère digestion du plasmide non recombinant par BamHI a été effectuée (donnant un fragment de 3500), faut-il alors s’aider de celle ci ?
Merci bcq

 
Si tu as 4 bandes avec une double digestion (Edit : d'un plasmide), c'est que tu as quatre sites de restriction. Pour ce type d'exercice, le plus simple est toujours de faire un schéma pour déterminer la position relative des sites de restriction des différentes enzymes puis pour déterminer si ces site sont dans le plasmide vide ou dans l'insert.

 
 
Dans le cas de la mucoviscidose, ce problème n'est probablement pas le plus complexe. Tu utilises en spray nasal un vecteur incapable de se répliquer et tu atteindras uniquement les cellules pulmonaires. Même si d'autres cellules sont touchées, ce n'est pas vraiment un problème SI le gène s'insère correctement. Le plus gros problème reste de pouvoir contrôler les sites d'insertion du gène et surtout d'éviter qu'il aille s'insérer au milieu de p53 ou d'un autre gène du même acabit. C'est un peu le gros problème des vecteurs rétroviraux et à ma connaissance, ce problème n'est toujours pas résolu et il ne faut pas avoir peur des leucémies si on se porte volontaire pour un essai thérapeutique à base rétrovirale. Il y a d'autres virus qui permettent d'éviter ces écueils (l'adénovirus ou l'AAV notamment) mais ils ne sont pas non plus sans dangers pour le moment. Disons qe pour le moment, la thérapie génique est un échec même si il y a encore beaucoup de solutions possibles.

Le schéma proposé par Aragorn reste valable, vu que tu as strictement la même situation.
 
Si tu regardes donc, les deux coupent au milieu de l'autre. => chaque bande de 1000 est coupée en son milieu. Tu as 2 bandes de 1000 qui se chevauchent à moitié, donc 1500 pb. Pour donner 3 bandes, tu as 4 bornes. Toujours l'histoire des piquets et des intervales, quelle que soit la façon dont tes profs aimaient appeler ça.
Il n'y a pas une "enzyme qui coupe l'autre" pour reprendre ton expression (maladroite).
 
Enfin ton histoire de BamHI qui avait un seul site BamHI avant insertion, c'est exactement ce que j'ai expliqué plus haut. Tu vas choisir un site unique, pour insérer ta séquence à amplifier. Tu vas utiliser des enzymes qui donnent des extrémités cohésives. Si tu emploies une enzyme à bouts francs, tu perds la spécificité, et tout, rien, n'importe quoi peut s'insérer, c'est la merde. Donc ton fragment va s'inserer (dans un sens ou dans le sens inverse, vu que ton site BamHI est palindromique), en s'appariant avec chacune des extrémités, donc en reconstituant le site de départ, mais à chacune des extrémités du fragment. Donc ton site unique de départ, est maintenant présent à chacune des extrémités de ton fragment, ce qui est bien pratique pour le retrouver par la suite.
 
J'espère que ça fait pas trop pavé, et si tu as encore du mal à visualisé, envoie un MP, je t'enverrai des figures...

Putain si je croise un techos d'invitrogen je lui coupe les couilles et lui fait bouffer      
 
Ca fait 3-4 ans que vector NTI est en free-license pour les academics, j'ai tous mes oligo, plasmides.
Depuis qq semaines c'est payant, j'ai meme pas acces a mes data    
 
Bande de moins que rien.
 
Je commanderai plus jamais chez ces encules.

Faut passer à la caisse.

Fais leur un plaidoyer sur l'éthique de la science, le développement pour le bien de l'humanité.... et rends toi compte qu'ils en ont rien à fiche, vas chercher ton directeur de labo, et demande lui des sous!

 
On va les menacer de plus commander les gels de prot' chez eux.
 
Tout l'institut c'est des dizaines de milliers d'euro par mois.
 
 
Mais je ne reviens pas sur ma decision, si je croise un techos, gare a ses couilles