Reprise du message précédent :
tu t'es fait scooper?

Non, juste un rhum

Vieilli en fut de chene ?  

Bon je recherche un truc assez con

Un bête graphique qui montrerait l'évolution globale de la synthèse protéique en fonction de la croissance d'une bactérie... F (DO croissance) = concentration en protéine quoi.

J'ai d'énorme soucis dans mes cinétiques de croissance avec ce taux de protéines... J'aimerai bien voir un schéma bon pour pouvoir trouver ou ça coince chez moi

Merci de votre aide

alors là, comme tout problème de bio (et d'expression de protéine) ça dépend!
Certaines protéines sont exprimées en phase exponentielle, d'autres en fin de phase exponentielle (les toxines de staphylocoque par ex); pour certaines il faut surtout récolter en phase expo, car dès le début de phase de latence, il y a protéolyse.
Il faut que tu fasses toi même ton blot, sur des petites cultures de bactos que tu amènes à différentes D, et tu suis ensuite l'expression de ta protéine, tu n'as pas vraiment le choix.

Nan la je cherche juste à estimer la porduction de prot globale en fonction du temps.
 
Pour y ramener ma synthèse de sucre en fonction de ma quantité de prot.
 
Le soucis c'est que j'ai jamais la même cinétique pour les prot
 
Donc j'aurai aimé savoir la quantité de protéine produite en fonction du cycle de vie, je p trouve pas pour les prot globales juste pour des prot du cycle ou autre...
 
Je pense que ça doit bêtement suivre la cinétique de croissance (plus j'ai de bactos plus j'ai de protéine) mais je voudrai être sûr mais je trouve un peu rien sur pubmed ou sur google

tu peux le faire facilement toi même alors,    
mais il faut que tu ramènes à ta biomasse, sinon tu auras forcément un truc linéaire

Est-ce qu'il y a des gens ici qui sont sur le campus WellcomeTrust-Sanger-EBI ?

Bonjour tous le monde, j'ai une petite question de néophyte :
est-ce que l'on sait fabriqué n'importe quelle protéine??  

 
Qu´est ce que tu appelles "fabriquer n´importe quelle protéine" ?

Bordel j'ai accès à BioOne et personne me le disait
 
"Comment j'ai perdu 1 an à rien trouver en biblio à cause d'un problème de proxy"

Sympa.
 
J'ai eu un truc comme ça une fois. Proxy bien configuré pour IE, pas sous Firefox... Je pigeais pas pourquoi les revues auxquelles on était pourtant abonnés d'après le catalogue en ligne, ne voulaient pas me filer le moindre article!
 
cbstorm, tu veux dire quoi précisemment?
On sait synthétiser n'importe quelle séquence primaire avec des vieux séquençeurs à la con. On sait faire synthétiser des protéines dans des bactéries par expression de gènes d'intérêt... Donc ça dépend si tu parles déjà de synthèse "en machine", ou de moyens qui restent "biologiques". Ensuite, si on parle de protéines fonctionnelles, avec le bon repliement, avec les glycosylations qui vont bien et tout ça...

 
Même sans parler de structure 3D correcte, je ne suis pas certain qu'une bactérie serait capable d'enchainer les 30000 aa de la titine sans faire d'erreur

Bah, c'était juste pour montrer que la question était incomplète. Après, si monsieur est tatillon!

comment on fait pour faire synthétiser des proteines aux bactos ? on leur donne de l'ARNm à manger ?

On y insère une construction nucléique (avec un gène) qui utilisera la machinerie cellulaire de la bactérie pour transcrire ce gène et synthétiser ces protéines.

ben euh, je veux dire fabriquer une protéine de 3000 acides aminés bien précise en grande quantité. Après le mode de fabrication, j'en sais rien....

Non, mais dans quel cadre tu poses ta question? Quelle type de protéine? Qu'est-ce que tu appelles "grande quantité"? Quel type de gène?...

 
Cellules d'insectes en culture (sf9), 3000 aa c'est bcp trop gros pour une bactouille.

En grande quantité il a dit, le Monsieur
 

Via les plantes alors

3000 acides aminés, c'est déjà une bête de protéine non?
 
Et puis plante ou animal, on est limité aux 20 acides aminés "naturels". Et on ne maîtrise pas la synthèse des protéines via le NRPS des bactos. Fabriquer n'importe quelle protéine in vivo, ça me parait difficile, du coup.
 
Personnellement, je répondrais "non" à la question mais je ne sais pas ce qui se passe du côté des labos/industries de chimie.
 
Enfin, fabriquer une protéine, c'est bien beau mais... A quoi bon?

En fait je pensais à une protéine un peu comme l'insuline fabriquée normalement par le corps humains mais qui dans certains n'est pas fabriquée d'où maladie. Dans ma tête c'était plus le séquençage de la protéine mais je n'avais pas pensé aux conformères (si je ne me trompe pas ??) et toussa. Donc l'idée c'était de me représenter la difficulté pour parvenir à guérir cette maladie, si on a la protéine y a qu'à chercher où comment et combien injecter et sinon d'abord savoir la fabriquer mais bon c'est juste à titre informatif...
Merci par avance.

Alors pour l'insuline, pour la petite histoire, on l'extrayait du pancréas de chiens (ou de porcs, je ne suis plus bien certain) vivants pour traiter le diabète.
 
Aujourd'hui on utilise des bactéries génétiquement modifiées qui peuvent produire la protéine de façon industrielle.
 
Pour l'obtention d'une protéine de cette façon, il ne suffit donc pas seulement de connaitre sa séquence en acides aminés, mais aussi identifier le gène "d'origine", le modifier de façon à ce que la bactérie soit capable de synthétiser une protéine fonctionnelle chez l'Homme.
 

Ca me rappelle la petite histoire que j'avais appris quand je bossais chez Serono. Historiquement, la boîte s'est faite une bonne place dans les années 50-60 en fabricant un traitement pour la fertilité à base de gonadotropine. Le truc c'est que le seul moyen pour extraire ça à l'époque c'était en purifiant en masse à partir d'urine de femmes ménoposées. Etant donné qu'à cette époque le Vatican était un actionnaire majeur de la boîte, les donatrices principales de matière première étaient des nonnes mises "à disposition" par le clergé...

 
L'insuline, c'est un peu le cas d'école de la protéine facile à utiliser d'un point de vue thérapeutique. C'est une toute petite protéine (donc facile à fabriquer) agissant dans le milieu extra-cellulaire, donc on n'a pas à se préoccuper du problème incroyablement difficile du franchissement de la membrane cellulaire.  
Dans les cas un peu plus complexes mais encore raisonnables de protéines produites à des fins thérapeutiques, il y a les protéines interférons qui sont un peu plus grosses et qui elles aussi agissent dans le milieu extra-cellulaire.

Y a l'EPO aussi  

 
un volontaire pour faire une fusion EPO-GFP histoire de s'amuser au prochain tour de France ?

Pour la petite histoire la protéine à laquelle je pense c'est la neurofibromine (2818 aa).

 
2818 aa, c'est à priori très mal engagé si tu veux des quantités compatibles avec un usage thérapeutique. Cela dit, ça me parait très gros pour une protéine dans le milieu extra-cellulaire. Si elle est membranaire, c'est à 99,999..% foutu d'avance et si elle est cytoplasmique/nucleaire egalement, il faudrait que ta proteine soit insensible aux conditions oxydantes/reductrices (c'est peu probable vu la taille du bestiau) et il faudrait egalement trouver un moyen de lui faire franchir la membrane plasmique. Pour être honnête, à part les protéines membranaires je pense qu'il n'y a pas beaucoup de protéines plus inadaptées à un usage thérapeutique.
 
La protéine idéale pour un usage thérapeutique est petite (<500 aa de preference, ça permet d'espérer une bonne production en bactérie), sans modification post-traductionnelle et elle agit dans le milieu extra-cellulaire.

Ca ne sera plus le maillot jaune, mais le maillot vert (fluo).

Pour info, l'insuline on la produit chez la levure.
 
On essaye egalement dans le lait... de chevre.

http://www.uniprot.org/uniprot/P21359
Cellular component:
axon Inferred from direct assay. Source: HGNC  
cytoplasm Inferred from sequence or structural similarity. Source: HGNC
dendrite Inferred from direct assay. Source: HGNC
nucleus Inferred from sequence or structural similarity. Source: HGNC
 
 
Amino acid modifications
 Modified residue 2 1 N-acetylalanine By similarity  
 Modified residue 864 1 Phosphoserine Ref.20 Ref.26  
 Modified residue 2188 1 Phosphoserine Ref.26 Ref.22 Ref.25  
 Modified residue 2476 1 Phosphotyrosine Ref.23  
 Modified residue 2496 1 Phosphoserine Ref.25  
 Modified residue 2514 1 Phosphothreonine By similarity  
 Modified residue 2515 1 Phosphoserine Ref.20 Ref.26 Ref.24  
 Modified residue 2521 1 Phosphoserine Ref.26  
 Modified residue 2543 1 Phosphoserine Ref.26 Ref.25  
 Modified residue 2577 1 Phosphotyrosine By similarity  
 Modified residue 2829 1 Phosphoserine Ref.21

Apparement, c'est bactérie ou levure.

Si mes souvenirs sont bon je crois qu'avec les bactos et levure certaines modif post traductionnelles sont impossibles (N-glycosylation)
Pour l'insuline on utilise les N-glycosylation pour augmenter sa durée de vie in vivo, parce que même si on arrive à synthétiser la prot voulue, si ça durée de vie de ne dépasse pas une heure c'est mission impossible pour une application thérapeutique.

 
Il y a des N-glycosylations en levure mais les chaînes de sucre sont beaucoup plus courtes que chez les mammifères. C'est d'ailleurs là-dessus que se basait le premier test de détection de l'Epo, l'epo synthétisée en levure n'avait pas la même masse que l'epo endogène à cause de ces sucres.

oui mais ça dépend. Chez S cerevisiae, on est limité aux mannoses; pour pichia, je crois que les chaînes sont un peu plus longues.
Pour revenir à l'expression des prot membranaires, cela dépend aussi, et quasi tous les systèmes sont utilisés pour "tenter" de les produire, de la bactérie en corps d'inclusions, à la levure, en passant par les yeux de drosophiles, sf9 baculo ou S2 en expression stable.

 
Ca reste quand meme extremement difficile de produire des quantites decentes de proteines membranaires, meme aveec les baculovirus qui semblent donner de loin les meilleurs resultats pour ce type de proteines. Cela dit, dans ce cas le probleme ne se pose pas reellement, l´injection de proteines membranaires n´etant pas du tout adapte a un usage therapeutique.

oui c'est de l'ordre au max de centaines de ug / L de culture... ensuite c'est vrai pour l'instant on n'en est pas à injecter des micelles avec les prot dedans  

 
Il y a un certain nombre de cas ou on atteind quelques mg par litre de culture meme sans compter les productions en corps d´inclusions. Mais c´est vrai qu´en general, 100 ug c´est deja la fete !
 

 
Moi, je ne veux pas me faire injecter du detergent meme si il y a des proteines dedans. De toute facon, ca va aller directement dans les hematies et tu seras bien avance

sauf si tu vises les hématies    
ensuite, tu peux modifier ton liposome avec qqs"molécules" signal (sucres, lipides) qui vont l'adresser préférentiellement vers l'organe de choix