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Auteur Sujet :

[topik unique] Génétique, biologie moléculaire et structurale.

n°4698360
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 21:58:16  profilanswer
 

Reprise du message précédent :

Svenn a écrit :

Tout a fait d'accord. Les cellules humaines, ça coûte cher, ça pousse pas, ça crêve dès qu'il fait chaud, froid ou alors que tu lui as demandé de surproduire une protéine. En plus, il faut s'en occuper tous les jours, même le week-end et les jours fériés.
 
Moralité :  :kaola:


[:neo_xp] Mais nan il faut utiliser des cellules cancéreuse! [:ddr555]


---------------
La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
mood
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Posté le 24-01-2005 à 21:58:16  profilanswer
 

n°4698399
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:01:59  profilanswer
 

Les promoteure à la con style  Béta-gal à l'IPTG ça doit se faire nan?


---------------
La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698407
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:02:36  profilanswer
 

NHam a écrit :

Les promoteure à la con style  Béta-gal à l'IPTG ça doit se faire nan?


 
+1 t'as aussi la K7 tetra qui marche pas mal  :jap:


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698414
Svenn
Posté le 24-01-2005 à 22:03:13  profilanswer
 

NHam a écrit :

Les promoteure à la con style  Béta-gal à l'IPTG ça doit se faire nan?


 
C'est à ça que je pensais, mais je sais pas trop ce qu'il y a comme bon promoteurs inductibles en cellule humaine  :??:


Message édité par Svenn le 24-01-2005 à 22:03:33

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Winning an Ig Nobel is like winning a Darwin Award, and you don’t have to die
n°4698429
doberman12​1
c'est pas moi !!!
Posté le 24-01-2005 à 22:04:37  profilanswer
 

mouep mouep ...
 
 
je vais potasser tout ca !!!!!  :)  
 
et je vais tuivre ton conseil RykM en faisant plusieurs constructions pour ne pas me retrouver dans une belle merde !!!
 
au fait : Svenn , pour le siRNA et l'adénovirus .... c'est pas une fin en soit , si tu connais plus simple je suis preneur !!!
 
 
encore un fois MECI pour vos réponses  !!
 
 
 :jap:  :jap:

n°4698436
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:05:41  profilanswer
 

Svenn a écrit :

C'est à ça que je pensais, mais je sais pas trop ce qu'il y a comme bon promoteurs inductibles en cellule humaine  :??:


En revanche pour surexprimer à l'IPTG t'est Nikay...


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698440
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:06:10  profilanswer
 

Si tu nous donnais exactement le nom de ta prot' et ta lignee celluliaire on pourrait plus t'aider  ;)


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698447
doberman12​1
c'est pas moi !!!
Posté le 24-01-2005 à 22:06:40  profilanswer
 

NHam a écrit :

[:neo_xp] Mais nan il faut utiliser des cellules cancéreuse! [:ddr555]


 
 
je te le fais pas dire !!! se sont mes putains de cellules !!

n°4698456
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:07:29  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

je te le fais pas dire !!! se sont mes putains de cellules !!


 
Ne me dis pas que tu bosses sur des cellules HeLa  [:neo_xp]  


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698464
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:08:22  profilanswer
 

Le must de la surexpression c'est SV40! En 72H tes celluels sont fliguées! [:ddr555]


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
mood
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Posté le 24-01-2005 à 22:08:22  profilanswer
 

n°4698471
doberman12​1
c'est pas moi !!!
Posté le 24-01-2005 à 22:09:01  profilanswer
 

RykM a écrit :

Si tu nous donnais exactement le nom de ta prot' et ta lignee celluliaire on pourrait plus t'aider  ;)


 
problème ..la chose est dite "confidentielle" donc je peux pas trop parler  !!..mais merci pour votre aide !!!!

n°4698474
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:09:08  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

je te le fais pas dire !!! se sont mes putains de cellules !!


Ben ça pousse tout seul ça. [:mrbrelle]
Enfin moi j'avais pas de problème.


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698480
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:09:39  profilanswer
 

NHam a écrit :

Le must de la surexpression c'est SV40! En 72H tes celluels sont fliguées! [:ddr555]


 
C'est pas pour rien que les premiers modeles du cycle cellulaire chez les mammiferes ont ete faits avec lui  [:rykm]


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698481
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:09:51  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

problème ..la chose est dite "confidentielle" donc je peux pas trop parler  !!..mais merci pour votre aide !!!!


Ben tu nous envoie ça en MP et on en discute ici. [:croquignol]


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698488
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:10:40  profilanswer
 

Pour revenir à la sélection, de toute façon tu t'en fout, c'ets du transitoire? nan?


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698490
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:10:47  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

problème ..la chose est dite "confidentielle" donc je peux pas trop parler  !!..mais merci pour votre aide !!!!


 
Moi j'ai revele le contenu d'un papier dans Cell 3 mois avant sa parution  :D  
 
Mais bon, on te comprend  ;)


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698518
Svenn
Posté le 24-01-2005 à 22:14:03  profilanswer
 

NHam a écrit :

Le must de la surexpression c'est SV40! En 72H tes celluels sont fliguées! [:ddr555]


 
Avec du VSV, je te transformes un tapis cellulaire en champs de ruines en 12 heures. Même Rambo, c'est un amateur à côté  :o


Message édité par Svenn le 24-01-2005 à 22:14:31

---------------
Winning an Ig Nobel is like winning a Darwin Award, and you don’t have to die
n°4698527
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:14:57  profilanswer
 

Je fait pareil avec de l'eau de javel! [:skeye]
[:dehors]


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698537
doberman12​1
c'est pas moi !!!
Posté le 24-01-2005 à 22:15:59  profilanswer
 

NHam a écrit :

Pour revenir à la sélection, de toute façon tu t'en fout, c'ets du transitoire? nan?


 ben le truc c'est que les cellules n'ayant pas recu le gene d'interet vont continuer a se comporter comme si de rien ..donc elles vont fausser mon résultat ...
genre elles continuent a se developper (diviser) alors que les autres arrètes...
 
donc pour moi la selection est importante pour isoler mes cellules et voir leur comportement  

n°4698540
Svenn
Posté le 24-01-2005 à 22:16:06  profilanswer
 

NHam a écrit :

Je fait pareil avec de l'eau de javel! [:skeye]
[:dehors]


 
Oui, mais moi au moins, j'ai les protéines que je veux à la fin  :o


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Winning an Ig Nobel is like winning a Darwin Award, and you don’t have to die
n°4698554
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:17:17  profilanswer
 

NHam a écrit :

Je fait pareil avec de l'eau de javel! [:skeye]
[:dehors]


 
 
Ca me fait penser...
 
La levure (cerevisiae) resiste a 2h de traitement a la javel [:h a w k]


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698559
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:17:35  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

ben le truc c'est que les cellules n'ayant pas recu le gene d'interet vont continuer a se comporter comme si de rien ..donc elles vont fausser mon résultat ...
genre elles continuent a se developper (diviser) alors que les autres arrètes...
 
donc pour moi la selection est importante pour isoler mes cellules et voir leur comportement


Antibiotique power! Enfin c'ets  ce que je ferais... c'ets le plus courant je pense.


---------------
La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698566
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:18:20  profilanswer
 

RykM a écrit :

Ca me fait penser...
 
La levure (cerevisiae) resiste a 2h de traitement a la javel [:h a w k]


Ouai je sais j'ai contaminé une boîte avec des levure une fois (lendemain de fête...) ben je me suis marré après. :/


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698599
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:22:59  profilanswer
 

Pour la transfection c'est phosphate de calcium?
Et pour les plasmides, il te faut je sais plus combien de fois le plasmide de résistance par rapport au plasmide d'intérêt.
(l'utilité de ma dernière phrase :sarcastic: )


---------------
La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698602
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:23:25  profilanswer
 

NHam a écrit :

Ouai je sais j'ai contaminé une boîte avec des levure une fois (lendemain de fête...) ben je me suis marré après. :/


 
Et moi je te parle des levures de labo, pas les sauvages  [:neo_xp] qui sont assez fortes pour contaminer les cultures cell  :jap:  


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698615
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:24:48  profilanswer
 

NHam a écrit :

Pour la transfection c'est phosphate de calcium?
Et pour les plasmides, il te faut je sais plus combien de fois le plasmide de résistance par rapport au plasmide d'intérêt.
(l'utilité de ma dernière phrase :sarcastic: )


La transfection ca depend, y a plein de composes maintenant, les boites de biotech s'en sont donnees a coeur joie pour sortir de nouveaux produits  [:huit] D'apres ce que j'ai pu comprendre c'est la lignee qui compte le plus  [:figti]


---------------
Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698617
doberman12​1
c'est pas moi !!!
Posté le 24-01-2005 à 22:25:02  profilanswer
 

je dois y aller !!!
je vous tiens au courant de mes avancer .... on y croit fort  :sweat:  :D
 
merci a tous !!!  
 
 
a+  

n°4698620
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:25:39  profilanswer
 

:jap: je me souviens que l'incubateur de la salle d'à côté était bourré de levure. Alors on peut considéré ça comme de la levure "d'élevage"!
 [:god]
 
 
 
Nan en, fait j'ai manipulé comme un porc se jour là... :/


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698636
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:27:23  profilanswer
 

RykM a écrit :

La transfection ca depend, y a plein de composes maintenant, les boites de biotech s'en sont donnees a coeur joie pour sortir de nouveaux produits  [:huit] D'apres ce que j'ai pu comprendre c'est la lignee qui compte le plus  [:figti]


Je transfectait des 293 EBNA.
mais je produisais ma protéine soluble secrété dans le milieu alors c'était plus simple, je me moquais pas mal de la sélction.  [:androids974]  
Je récupérais le surnageant au bout de 2 jours.


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698645
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:28:33  profilanswer
 

NHam a écrit :

:jap: je me souviens que l'incubateur de la salle d'à côté était bourré de levure. Alors on peut considéré ça comme de la levure "d'élevage"!
 [:god]
 
 
 
Nan en, fait j'ai manipulé comme un porc se jour là... :/


 
Une contamination de ce genre est tres improbable: les levures de labo sont gardees (expres) a l'etat halpoide, donc elles ne forment pas d'asques (avec plein de spores de colonisations) perso toutes les conta' que j'ai vu en culture cell' etaient soit des bactouilles (qui etaient presentes depuis le debut je pense) soit des moisissures (le must  [:huit] ) soit des levures sauvages(c'est flagrant elles sont 2 fois plus petites que les levures de labo) :D


Message édité par RykM le 24-01-2005 à 22:29:15

---------------
Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698661
Svenn
Posté le 24-01-2005 à 22:31:10  profilanswer
 

RykM a écrit :

Une contamination de ce genre est tres improbable: les levures de labo sont gardees (expres) a l'etat halpoide, donc elles ne forment pas d'asques (avec plein de spores de colonisations) perso toutes les conta' que j'ai vu en culture cell' etaient soit des bactouilles (qui etaient presentes depuis le debut je pense) soit des moisissures (le must  [:huit] ) soit des levures sauvages(c'est flagrant elles sont 2 fois plus petites que les levures de labo) :D


 
Les bactéries contaminantes, je maîtrises aussi. En plus, je m'en occupe super bien : je les nourris à la protéine purifiée à 200 euros le milligramme, les veinardes  :love:


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Winning an Ig Nobel is like winning a Darwin Award, and you don’t have to die
n°4698670
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:32:20  profilanswer
 

Pas besoin de former d'asque pour que la levure pousse.
Elle bougeonnent très bien toutes seules.
Celà dit, je cultivais sans antibiotique! C'est mieux pour les manip, mais c'est plus astreignant (orth?) pour la culture. Faut être plus rigoureux.


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698677
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:33:00  profilanswer
 

Svenn a écrit :

Les bactéries contaminantes, je maîtrises aussi. En plus, je m'en occupe super bien : je les nourris à la protéine purifiée à 200 euros le milligramme, les veinardes  :love:


Tu travailles dans la cantine du labo? [:ddr555]


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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4698694
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 24-01-2005 à 22:35:14  profilanswer
 

NHam a écrit :

Pas besoin de former d'asque pour que la levure pousse.
Elle bougeonnent très bien toutes seules.
Celà dit, je cultivais sans antibiotique! C'est mieux pour les manip, mais c'est plus astreignant (orth?) pour la culture. Faut être plus rigoureux.


 
 
T'as pas compris ce que j'ai dit(ou je me suis mal exprime   :D  ), si pas diploides pas de meioses mais uniquement des cellules mitotiques ==> peu colonisatrices (paroi pas resistante etc..) mais qui poussent tres bien (2h de temps de generation  [:dao] )


Message édité par RykM le 24-01-2005 à 22:36:45

---------------
Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4698719
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 24-01-2005 à 22:39:10  profilanswer
 

Ah ok j'avais compris que tu disais qu'elles pouvaient pas se multiplier. [:japv]
Au temps pour moi.
EDIT: c'est moi qui ai mal compris.
Tu as bien expliqué qu'on ne pouvait pas avoir de conta par spore de colonisation. J'ai mal lu (encore une fois...) mais effectivment à moins de foutre ta main dedans et de la secouer au dessus de tes cultures normalement la conta c'est chaud bouillant avec les levures de labo...


Message édité par NHam le 24-01-2005 à 22:43:43

---------------
La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4699444
bank
grin and bear
Posté le 24-01-2005 à 23:47:21  profilanswer
 

doberman121 a écrit :

le truc que je veux faire :
1/
je veux éteindre un gene dans des cellules humaines
mon idée : ????
peut etre insérer un siRNA .... vecteur adénovirus ...pas facile à faire il faut avoir une bonne sequence homologue du RNAm cellulaire pour provoquer une hybridation .
 
si vous connaissez d'autre technique ..je suis preneur !!
 
2/
je voudrais surexprimer un  gene dans des celulles humaines  
 
3/ autres sujet ..je voudrais voir l'effet de l'inactivation/activation d'un protéine dans les memes celulles
 
je pensais coupler le gene de ma protéine sur un promoteur Heat shock  
 qu'en pensez vous ?  
 
 
les cellules humaines, ouais c'est nulle, mais pour se rapprocher d'un modèle in vivo  y' a pas mieux  .... donc c'est pas de ma faute  !!
 
merci pour vos lumières !!! je rame


 
T'as plusieurs possibilités:
 
1) essayer de faire une proteine de fusion "ta prot"-gfp -> pas facile parce qu'il faut s'assurer que ton GFP anchoré va pas modifier les propriétés de ta prot. Mais ça se fait et ça marche selon les cas (qqun chez nous a une actine-gfp qui marche très bien)
 
2) mettre un IRES-GFP après ton gène. L'expression des gènes sous IRES est toujours plus faible que ton gène en amont mais ça peut très bien marcher selon ta lignée cellulaire (et si c'est juste pour voir si c'est vert ou pas, c'est pas critique). J'ai des vecteurs avec IRES-GFP ou IRES-dsRed qui crachent bien dans les 293T avec une simple transfection CaPO4 p.ex.
 
http://img179.exs.cx/img179/7711/wpi17yr.gif
 
3) mettre 2 promoteurs dans ton plasmide. Par example, prom. EF1alpha - gène rapporteur - H1 - siRNA
 
http://img179.exs.cx/img179/5343/lvth16km.gif
 
Tout ça chez http://www.tronolab.com/
 
Tu peux aussi faire de l'inductible avec ces plasmides, système Tet represseur avec petite subtilité: le TetR est fusionné à la prot. KRAB qui silence la chromatine alentour -> le but est de diminuer la "leakiness" (càd expression basale en condition sans inducteur) inhérente aux systèmes inductibles.
 
(ce sont des plasmides à la base pour transduction avec vecteur lentiviral)


Message édité par bank le 24-01-2005 à 23:57:22
n°4699497
bank
grin and bear
Posté le 24-01-2005 à 23:54:07  profilanswer
 

Bon ni le 1) ni le 2) sont possibles dans le cadre du siRNA :O
 
et comme disait RykM, tu peux bien sur cotransfecter 2 plasmides, si tu arrives à avoir un taux de transfection proche du 100% (en bidouillant les protocoles et/ou en testant les diverses méthodes de transfection), c'est pas un problème [:spamafote]


Message édité par bank le 25-01-2005 à 00:22:15
n°4702656
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 25-01-2005 à 12:54:15  profilanswer
 

J'aime ce genre de reponse  :jap:  
 
Ca donne au topik un caractere serieux  :sol:  
 
Merci Bank  [:dao]


---------------
Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
n°4706346
Svenn
Posté le 25-01-2005 à 20:14:55  profilanswer
 

RykM a écrit :

J'aime ce genre de reponse  :jap:  
 
Ca donne au topik un caractere serieux  :sol:  
 
Merci Bank  [:dao]


 
Ce topic est depuis sa création un des hauts-lieux de la connaissance et du savoir sur HFR  :o


---------------
Winning an Ig Nobel is like winning a Darwin Award, and you don’t have to die
n°4706367
NHam
Stop, look and listen.
Posté le 25-01-2005 à 20:16:14  profilanswer
 

Avec des gens compétents et plein d'humilité? [:opus dei]
 
 
[:_edit] Je sors c'est çà?


Message édité par NHam le 25-01-2005 à 20:16:34

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La différence entre la sensualité et la perversion: La sensualité c'est avec la plume, la perversion avec le poulet entier.
n°4706375
RykM
t'as de beaux gènes, tu sais..
Posté le 25-01-2005 à 20:16:38  profilanswer
 

Tout a fait d'accord, pas l'ombre d'un troll, pas une goutte de godwin point  [:dao]


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Chacun pense ce qu'il veut... moi je veux ce que je pense
mood
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