Reprise du message précédent :
Je comprends pq 53 Nobel US soutiennent officiellement Obama  

 

 
http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(08)01116-1

Allo, Mamzelle Bardot?  
   
'fin l'embryo, c pas défaut un truc qui me gave

bonjour
 
Je recherche des infos sur l'acétylcholinestérase, en particulier :
 
- le mécanisme d'hydrolyse de l'acéthylcholine par l'acétylcholinestérase  
- l'inhibition de l'enzyme par les organophosphérés  
- la cinétique des ces deux phénomènes
 
Mon problème, c'est que je ne recherche pas à étudier cela sur le plan biologique (le rôle de l'acétylcholine en tant que neurotransmetteur, les potentiels d'action, tout ça c'est HS), mais sur le plan strictement chimique (attaques nucléophiles, etc)  
 
J'ai consulté quelques livres de biochimie, ainsi que des sites internets, mais ils restent relativement évasif sur le coté chimique de l'affaire. J'ai néamoins trouvés quelques bons trucs dans le "Biochimie" de Donald Voet.  
Donc j'aimerai que vous m'indiquiez de bonnes références françaises/anglosaxonnes, autant en livres que sur internet  
 
Ce link a répondu à une partie de mes questions, notamments sur l'hydrolise, c'est ce genre d'informations que je recherche :
 
http://www.steve.gb.com/science/re [...] nisms.html
 
J'aurai par ailleurs besoin d'être éclairé sur le rôle du glutamate :
 

 
Car toujours dans le "Biochimie" de Voet, on trouvait le mécanisme d'hydrolyse de liaisons peptidiques chez les protéases à serine, indiquant qu'il était analogue à celui d'hydrolyse des esters par les estérases à serine. Cependant, dans le cas des protéases, une sorte de cycle contenant de l'azote, lié à de l'"His 57" jouait un rôle, donc j'aimerai savoir si c'est le cas aussi du glutamate ici, et comment  
 
Par ailleurs, je peux me procurer de l'enzyme et de l'acétylcholine, mais j'aimerai savoir quels genre de manip accessible à un niveau prépa (je suis en PC) serait possible. J'ai pensé à une étude cinétique par spectro (étant donné que dans les échantillons que j'ai, un réactif rend le produit bleu si l'hydrolyse se passe correctement) et ensuite pipoter un truc sur Michaelis/Menten  
 
J'ai aussi pensé à synthétiser de l'acétylcholine moi même, est-ce possible ? Car je bute immanquablement sur comment faire pour fabriquer l'ammonium quaternaire (car avec la méthode d'Hoffman on obtient un ammonium quaternaire avec 4 substituants indentiques, alors qu'ici il me faut 3 substituants méthyl et un éthyl. De plus il faudrait ensuite arriver à mettre une fonction alcool sur l'éthyl, pour ensuite faire une bonne vieille estérification avec de l'acide acétique). Mais peut être que ce dernier point c'est plus pour le topic chimie
 
merci  

Bonjour,
 
J'ai besoin d'aide des spécialistes en structure et enzymatique.
 
Quel pourrait être l'effet d'une mutation d'une Alanine (Ala) en Sérine (Ser) (et vice-versa) ? La grosse différence entre ces deux acides aminés est que l'un est hydrophobes et l'autre polaire.
Quel serait les propriétés de cette mutation sur la structure, d'un point de vue local et global, en admettant que ce résidu est dans la structure ?
Y'aurait-il moyen d'investiguer cet effet avec des structures PDB et des logiciels de dynamique moléculaire ou autre ?

 
Je ne connais pas cette enzyme precisement mais le glutamate a tres certainement un role ans la specificite de l´enzyme. Tu remarques sur le schema que ce glutamate permet de positioner une charge negative juste en face de la charge + de l´azote et permet de stabiliser le substrat suffisamment longtemps pour que la catalyse chimique puise se faire. Une molecule analogue a l´acetylcholine sans charge - ne pourrait pas se stabiliser suffisamment.
 
Je te conseille d´aller te renseigner sur la trypsine, la protease a serine la mieux etudiee (Pour ce que tu veux faire, la page wiki en anglais est pas mal faite). Il se trouve que cette protease a la propriete de couper les proteines specifiquement au niveau des lysines et arginine (les deux acides amines charges + a pH 7) et tu observeras la presence d´un glutamate (ou un aspartate, je ne sais plus) jouant exactement le meme role en stabilisant l´acide amine charge + pendant que la serine attaque la liaison peptidique.
 
Si tu connais un etuiant en biochimie, ca peut clairement valoir le coup de lui demander de l´aide t de jeter un coup d´oeil a la structure de la proteine avec et sans ligand et de regarder comment sont positionnes les acides amines autour du ligand et comment ils contribuent a stabiliser le substrat et lui seul. Sans aide, ca sera clairement plus difficile mais si tu as le courage (sans personne pour t´expliquer, ca fera probablement une bonne apres-midi de prise de tete), voila les elements dont tu auras besoin et que tu peux telecharger gratuitement : il te faudra les fichiers de coordonnee de l´acetylcholinesterase sans ligand (1J06) et en complexe avec un analogue non hydrolysable (2HA2 par exemple, avec de la succinylcholine) que tu peux recuperer ici : http://www.rcsb.org/pdb/cgi/explore.cgi?pdbId=2HA2 (et en remplacant 2HA2 par 1J06 pour la forme sans ligand). Plusieurs formats sont disponibles, il te faut les fichiers .PDB. Tu auras egalement besoin du logiciel libre pymol  pour visualiser la proteine et son ligand en 3D : http://www.pymol.org/. Il y a un wiki pour utiliser le tout, mais tu auras certainement besoin d´aide, je pourrais t´expliquer un peu plus en detail une fois que tu auras recupere tout ca si ca  t´interesse.r
 

 
Le cycle en question est un imidazole, qui est une base faible (pKa voisin de 6) et qui peut agir comme un nucleophile et former des liaisons H en temps qu´accepteur (et eventuellement activer ainsi des liaisons chimiques). Il faut voir dans ton cas si c´est l´un ou l´autre (ou autre chose !)
 

 
Ca me semble tout a fait raisonnable.
 

 
C`est peut etre faisable mais je ne deconseille fortement de te lancer dans ce genre de truc. L´acetylcholine est une molecule extremement importante dans l´organisme et les analogues de cette molecule (issus d´une reaction incomplete ou de produits secondaires) sont potentiellement fortement toxiques. Un des inhibiteurs de l´acetylcholine esterase (le PMSF) est notamment un des poisons les plus violents qui soient (meme si tu n´as aucun risque de synthetiser ce produit par erreur). Si tu as un protocole "garanti sans danger", c´est par contre peut etre jouable mais demande quand meme l´avis a tes enseignants.
 
Edit : pour la synthese de l´acetylcholine, il faudrait efectivement le faire a partir de la choline (tu enleves lé CH3-COO tu le remplaces par un OH). Tu obtiens la choline elle-meme a partir de l´ethanolamine H3N+ - CH2 - CH2 - OH qui n´est pas tres compliquee et qui devrait etre un bon point de depart.

 
C´est difficile a dire sans voir la structure et/ou sans informations sur ce residu. Si l´alanine est enfouie, sa mutation en un residu plus gros et qui plus est hydrophile peut poser des problemes steriques et destabiliser la structure de la proteine. Le probleme de l´hydrophilie peut etre attenue si le groupement hydroxyle a un groupe fonctionnel a portee de liaison H (a moins de 3,2 Angstrom de l´oxygene du OH) La serine etant un petit residu, les effets devraient dans ce cas rester limites et la proteine sera probablement plus fragile mais c´est tout.
Si c´est en surface, les effets devraient etre negligeables (a part peut-etre une solubilite vaguement augmentee) a moins bien sur que cette alanine ait un role fonctionnel auquel cas il faut connaitre ce role pour pouvoir repondre. C´est cependant rare qu´une lanine ait un role fonctionnel.
 
Il y a surement moyen d´etudier les effets avec les logiciels de structure, je commencerais par regarder tous les residus au voisinage de l´alanine (< 5 Angstrom du Cbeta), puis a le muter en serine et regarder s´il y a de la place pour le OH.

L'acide glutamique (glutamate) sert juste a donner l' ion H+ nécessaire à l'initiation de la réaction, il me semble, plus peut-être stabilisation du substrat par interaction ionique (comme précisé plus haut).

Svenn : merci pour tout    
 
Le bouquin mentionnait en effet la proximité entre les protéases et les estérases à serine. Il présentait l'exemple de la "Chymotrypsine" (plus très sur du nom, mais ça commençait par C), en montrant le mécanisme d'hydrolise de peptique, que voilà :  
 

 
Or le livre mentionnait que le mécanisme des estérase était "presque identique". J'ai donc bâti seul un mécanisme analogue d'hydrolyse de l'acétylcholine, qui fonctionnait parfaitement. Jusqu'à que je découvre grâce au site que j'ai mentionné que l'imidazole était remplacé par le glutamate, tout en ne précisant pas son action. Mais en effet je pense que c'est exactement pareil : le 3e doublet non liant au bout de l'oxygène du glutamate doit avoir exactement le même rôle que le doublet de N chez l'imidazole    
 
Je tenter de vérifier cette hypothèse, mais j'en suis presque certain.  
 
Pour ce qui est des liens que tu m'a donné, je vais voir jusqu'où je pousse ma recherche : l'oral de TIPE ne durant que 10 min (et pas de dossier à rendre, sauf aux ENS), je ne sais pas jusqu'a quelle précision je vais aller, mais pour l'instant je pense modéliser mon enzyme par une simple "patatoide" possédant la sérine et le glutamate, étant donné que c'est un TIPE de chimie et non de biologue Je ferai le point avec la prof à la rentré à ce niveau
 
Pour ce qui est des dangers, je suis au courant : en fait, j'étudie cette enzyme car c'est sur elle que repose ceci, qui m'a donné mon idée de TIPE :

 
c'est un petit matos de l'armée française destinée à repérer la présence ou non de gaz neurotoxique à base d'organophosphorés : on brise la capsule d'eau distillée pour mouiller le cercle d'acétylcholine, on agite dans l'air quelques minutes, puis on plie la plaquette pour mettre l'acétylcholine avec un le second cercle, de la cholinestérase : si tout va bien, l'hydrolyse a lieu en quelques minutes et ça vire au bleu. Sinon, c'est que des organophosphorés ont inhibés l'enzyme.  
J'ai lu dans un autre livre de biochimie l'action d'un organophosphosphoré sur cette enzyme : il vient se fixer sur la sérine (le livre prenait l'exemple du DIPF). Mais je vais continuer à chercher, ce n'est peut être pas aussi "simple"  
 
N'ayant trouvé aucun document et manuel militaire (j'ai de la famille dans l'armée) explicitant les mécanismes d'actions (ils se contentent de dire que c'est une réaction d'hydrolyse de l'acétylcholine catalysée par la cholinestérase, sans plus), j'ai donc décidé d'élucider le principe théorique par moi même, juste avec des bouquins et internet (plus des amis de 1er année de pharma qui vont voir dans leurs cours s'ils n'ont pas un petit quelque chose sur la question)  
 
 
 
 
Je n'ai bien sur jamais eu l'idée d'utiliser de vrais neurotoxiques (et puis j'ai aucun pote chez Al Quaida, donc pour s'en procurer ) mais j'ai eu une idée simple et pas cher : le gros Baygon anti-blattes qui pue est à base d'organophosphorés, je compte tester dès la semaine prochaine si le dosage du Baygon est suffisant pour inhiber l'enzyme de ma plaquette militaire (bien entendu en extérieur )  
 
Mon idée d'expérience est la suivante : après synthèse d'acétylcholine, je ferai une étude spectro avec celle-ci et les enzymes récupérés sur les plaquettes. D'abord un témoin, pour laisser l'hydrolyse se faire normalement, et montrer que l'évolution est cohérente avec les principes cinétiques de Michaelis et Menten qui semblent les régir, et si la solution Baygon marche, faire une seconde étude spectro avec différents échantillons "contaminés". J'ai eu un DM en sup entièrement consacré à la cinétique enzymatique d'après Michaelis, donc je ne devrais pas avoir de problèmes à ce niveau
 
Pour ce qui est de la synthèse d'acétylcholine, grâce au topic chimie je sais maintenant comment faire. Il faudra juste que je vois avec la prof si c'est réalisable concrètement au niveau de la sécurité (il y a une esterification bon là ça va, ma question concernera plutot la synthèse d'Hoffman à base d'éthanolammine)

 
C´est tres probable que le glutamate ait un role double, a la fois pour stabiliser le groupement choline et pour activer la serine de la meme facon que l´histidine active la serine des serine-proteases. Le groupe OH de la serine n´est pas specialement actif normalement et a souvent besoin d´une aide pour catalyser des reactions.
 

 
Ca peut etre une bonne idee de se renseigner sur le mecanisme du PMSF, qui est a la fois un inhibiteur irreversible des serine proteases et des serine esterases. L´inhibition des serine proteases par le PMSF a ete lagement etudie (c´est ce qu´on utilise classiquement dans les labos pour inactiver ce type de proteases), si tu trouves le mecanisme tu n´auras probablement aucun mal a en deduire le mecanisme d´inhibition dans le cas des esterases. Il me semble qu´il y a formation d´une liaison covalente entre le OH de la serine et l´inhibiteur (comme dans la situation normale) mais que l´enzyme n´est pas capable de briser ensuite cette liaison.
 

 
Ca me semble jouable, il n´y a plus qu´a se lancer !
 

 
Ce qui est peut-etre jouable, c´est de faire la synthese jusqu´a la choline (jusqu´a cette etape, il n´y a pas vraiment de danger meme si tu as plein de contaminants), puis de voir si ton prof peut trouver dans le commerce de la choline pure (c´est un produit pas trop cher) pour faire la derniere etape qui dans ce cas ne presente pas trop de risque. Ce qui serait vraiment risque, ce serait de realiser l´esterification sur de la choline avec 50% de contaminants et d´obtenir toutes sortes de produits plus ou moins exotiques. Mais demande quand meme un deuxieme avis !

 
Une structure PDB est fixe, résultant d'une cristallo le plus souvent. Dedans, c'est juste une série de coordonnées spatiales pour les différents atomes. Modifier un AA dans la struct ne change rien, le logiciel ne sait pas extrapoler les conséquences de la modif.
 
Si tu vas sur http://pbil.ibcp.fr , et plus précisemment dans http://pbil.ibcp.fr/~gdeleage/Cours/fascicules/L3/tp1/ , le point VI te propose des prédictions de structure. Si tu compares les 2 structures, avec ton Ala et avec ta Ser, est-ce que tu observes des modifs de structure secondaire notables? A noter que ça reste de la prédiction basée sur des modèles mathématiques, et que les différentes méthodes de prédiction ne donneront peut-etre pas toutes la même proposition de struct II...

D'un point de vue biochimique, cette enzyme existe sous les deux formes mutées (Ser et Ala), et sont pleinement fonctionnelles. Elles ont seulement des vitesses enzymatiques différentes.

J'avais déja fait un peu de modélisation par homologie sur ces séquences. La structure a exactement la même gueule, si elle est en Serine ou en Alanine. Mes séquences ont plus de 90% d'identité, et sans gap.  
Donc effectivement, une modélisation par homologie de l'une (Ser) ou l'autre (Ala) ne change pas la structure globale.

Même avec des calculs d'énergie libre ou de dynamique moléculaire ?

 
Dans ce cas, la première chose à faire est de regarder si elle est au voisinage du site catalytique ou pas. Si elle est proche, il faut voir si ce résidu pourrait aider à fixer le substrat et/ou pourrait faciliter la catalyse de la réaction enzymatique et/ou peut faciliter l'éjection du produit de réaction. Si cette mutation est à distance du site catalytique, c'est plus compliqué à expliquer. Il peut notamment s'agir d'un effet de stabilisation ou de déstabilisation de l'enzyme, il peut également y avoir une modification d'une éventuelle structure oligomérique. Dans ces deux situations, il y a sans doute de nombreuses autres possibilités mais il me semble que les hypothèses que j'ai cité sont les plus probables.

Surement. En fait, ce site est à la base d'une boucle qui s'ouvrirait et se refermerait sur le site catalytique. Donc je soupçonne qu'en Serine, la boucle s'ouvre plus vite et se referme plus vite qu'en Alanine.
Mais ça reste une hypothèse et j'aimerais tester cette hypothèse.
J'ai au moins dix séquences dans les deux cas, et l'identité étant très forte, je peux faire de l'homology modelling pour prédire chaque structure. Mais ensuite, j'aimerais utiliser une méthode pour voir où et comment se passe cette différence. Seulement, je ne sais absolument si :
1) C'est possible ?
2) Comment le faire et avec quel outil ? Dynamique moléculaire (charmm, gromacs, etc..) ? Mais ça risque de prendre des mois de calcul pour bouger une boucle.
.

 
Ca semble crédible comme genre d'hypothèses, il faut cependant la préciser un peu plus étant donné que tu as toujours plusieurs possibilités :
- Au repos, la boucle obstrue le site catalytique la plupart du temps avec un des deux résidus et réduit ainsi fortement l'activité enzymatique. Avec l'autre résidu, le site catalytique est plus souvent en position accessible.
- Dans les deux cas, la boucle est en position ouverte au repos. Après fixation du substrat au site catalytique, la boucle se referme sur lui. Une des deux formes de la boucle sera capable de former une liaison faible avec le substrat et restera plus longtemps en position fermée quand un substrat est lié. L'augmentation du temps de résidence du substrat augmente ainsi la probabilité qu'il soit processé (désolé pour l'anglicisme, je me rappelle plus du mot français) en un temps donné et augmente l'activité enzymatique.
 
Dans les deux cas et si c'est une protéine eucaryote, il faut peut être vérifier si la sérine n'est pas phosphorylable, ça pourrait démultiplier les effets de la mutation.
 

 
Je ne m'y connais pas du tout en homology modelling, jene peux pas trop te répondre sur la faisabilité. En temps que biochimiste, je crois que je partirais de la protéine, j'introduirais la mutation en sérine ainsi qu'en deux trois autres résidus à priori pertinents d'après la structure et ton hypothèse (genre une thréonine, une asparagine, une lysine et surtout dans le cas où la sérine est phosphorylable, un aspartate) et je mesurerai l'activité enzymatique du bestiau. Si tu as un test enzymatique déjà disponible, tu auras sans doute fini les manipes avant que les programmes ne te donnent une réponse pas forcément très claire.

Très honettement, je ne saurais trop te répondre. Déjà, on parlait de Pymol plus haut, moi j'ai bossé sur Yasara (ça change pas grand chose, basé sur du Python dans tous les cas). Mais j'aurais tendence à dire (noter le manquer de certitude) que le programme calcule une dynamique à partir de la structure entrée. Il part pour cela du fichier pdb, qui comme je le disais précédemment contient déjà les dispositions spatiales de tes différents atomes. Donc au pire il te calculerait une dynamique, mais si la position de base est erronnée, le calcul qui en découle est fatalement bancal... Je sais pas si je suis bien clair.
Si en revanche tu as déjà différents fichiers pdb qui incluent tes mutations, pourquoi pas. Mais ça reste de l'extrapolation statistique.... Et il faut une machine bien puissante.
Comme disait Svenn, mieux vaut s'intéresser aux AA à cotés, voir si ton alcool s'intercale dans une boucle qui est normalement assez "figée" par des interactions hydrophobes, s'il est phosphorylable... Après, j'ai quité la branche Bioch des prot et tout ça pour me pencher plus sur les molécules végétales à activité biologique

Il faudrait que je vois comment modeliser ça...

Je vais regarder ça.

Effectivement. Mais ça serait fun de voir ça au niveau de la structure 3D.

Très clair. Mais avec 90% d'identité, y'a pas de risque ça soit erroné.

J'ai !

J'ai aussi !

Ok, je vais checker ça.

Bon, j'ai lancé une petite dynamique pour voir ce que ça donne. La sérine (présente à gauche en CPK) forme parfois des ponts hydrogènes avec la Phénylalanine (à droite, en CPK) et parfois pas de ponts (logique, ça bouge). Je vais voir ce que ça donne lorsque l'alanine est à la place de la sérine.

 
Les phenylalanine ne peuvent pas former de liaisons H, la juxtaposition serine/phenylalanine est au contraire repulsive. Par contre, une alanine a la place de la serine devrait stabiliser l´interaction par liaisons de VdW.

Je me disais, je trouvais ça bizarre qu'il affiche un pont entre un acide aminé polaire et un aromatique hydrophobe. Comment est-ce possible que le programme affiche ça ?  
(VMD, coloration H-bond).

 
Je ne connais pas ce programme, peut-etre qu´il affiche automatiquement une liaison faible en-dessous d´une certaine distance ? Si la distance entre le O de la serine et le C le plus proche de la phenylalanine est inferieure a 4/4,5 Angstroms, la mutation alanine-->serine induit tres certainement une destabilisation de cette conformation de la boucle.

Thesis submitted    
 
Ce soir, grosse biture  

On vient où, pour ceux qui ont (cherché à) envoyer des publis?

Au fait Rasthor, fais tourner ton image, voire entre quoi et quoi il fait sa liaison hydrogène... Mais en effet, c'est space.
On en revient au même délire que la dynamique: le logiciel applique des logarithmes sans se poser de question. Il ne peut pas savoir ce qui se passe réellement, et parfois, plantage total, comme là ça semble être le cas.
On voit pas forcemment bien, mais ça semble être en périphérie... Donc une Alanine forme peut-etre plus de "liaisons hydrophobes" avec ta phénylalanine, que ça implique un peu de planquer tout ça de l'eau...
Si tu fais le mode "surface", t'as une modif entre les 2?..

salope
 
 jsuis encore en pleine ecriture, il me reste d'ici la fin du mois  

En fait, j'ai montré le mauvais résidu   (qui est aussi intéressant en soi ).  
 
Voilci donc la sérine qui m'intéresse:

 
Et l'alanine:

 
On voit bien que dans un cas, la sérine va attaquer l'oxygène du groupement carboxyle de la chain des carbones alpha d'en face. Et qu'il n'y a rien avec l'alanine.  Dans les deux, c'est des dynamiques moléculaires. Donc ça bouge, mais les images sont de bons exemples.
 
Si j'ai bien compris, la sérine pourrait aider à mieux stabiliser la structure en formant cette liaison ?

Joli.

tu l'as fait rapidos ton image ou c'est pour utiliser apres? je veux pas faire mon gros lourd mais c'est moche (même si on voit ton H bond).

Ben oui, c'est rapidos pour la poster.  

Le but est donc atteint !

ah ok
 
 moi je reste bluffé un max par les images de l'autrichien de http://chemical-quantum-images.blo [...] eptor.html (pyMol + quelques plugins...) il a fait plusieurs posts sur le sujet, c'est peut être deja passé

 
La serine "n´attaque" pas l´oxygene a moins bien sur que cette serine catalyse une reaction chimique sur ce carbonyle.
 
Sinon, c´est effectivement la probable explication de la difference entre les deux formes de la proteine. Dans l´ideal, il faudrait que la distance entre l´oxygene de la serine et l´oxygene du carbonyle soit inferieure a 3 angstroms, voire a 2,6 pour avoir une tres bonne stabilisation. Cela dit, comme ca vient d´un modele les positions ne sont sans doute pas precise au dixieme d´angstrom pres  

Ouaip, abus de langage de ma part.

Mais le modèle bouge (sur 20ps).
Sur 42 frames, j'ai une seule fois un pont à 2.6 angstroms. Par contre j'en ai beaucoup plus avec un cut-off de 3 angstroms.

J'ai relancé sur 200 ps. Réponse demain matin.

Y'en a qu'on voit pas assez au project chaos!

C'est où ? C'est quoi ?

 
Je l'ai ecrite en 3 semaines    
 
Tu as largement le temps  

Ca fait 3 ans qu'il y est lui

ça va alors , j'ai commencé y a une semaine, ça me laisse une semaine de marge

pas à ecrire.

 
Et je la defends dans 2 semaines  

ah quand même.

edit: ici on peut pas, faut 4 semaines administratives entre le depot de la these et la defense, supposé être pour que tout le commité lise la these mais surtout de la merde administrative