Reprise du message précédent :

 
Elongation a 68C, ca marche bien aussi pour faire des fragments jusqu'a 10 kb (avec la PFU Roche cela dit)...

 
Oui mais les photos sont toujours d'actualite  

 
Moi je parlais d'une Taq qu'on produit nous-meme, et qui doit meme pas etre proof-reading  

Je plaisantais...  

Bjr a tous
 
J’ai un petit souci !  je suis en plein prépas de mon TFE sur l’influence de la révélation par la nihindrine et l’1-2 indanedione sur les empreinte digital sur un support poreux en l’occurrence une lettre de la marque gallery!
 
Avec mon maître de stage on a essayé d’abord avec de l’ADN extrac pur avec un contrôle négatif seulement (on aurai du faire un positif aussi) bref a la pcr on a pas de résultat exploitable pour avoir un profil complet donc sa sers a rein…
 
Savez vous si il y aura des inhibiteurs dans le papier ? Car c galère pour extraire l’ADN, on passe l’étape de l’écouvillon car on pert trop de cellule on place direct la morceau de papier avec la protéinase k et la solution chelex 5% dans les éppendorff donc logiquement la papier a un influance notament inhibitrice sur l'adn mais qu'elle molécule ???
 
Des idée ?

Tu sais selon quel procédé est blanchie la cellulose dans ton papier?

 
j'ai regardé sur le net avant on utilisais le chlore, qui est a mon avis un inhibiteur
 
mais mnt c'est dan 75% des cas a l'H2o2 ou a l'azote mais la je coince...
 
 
édit : L’Europe occidentale n’utilise pratiquement plus le chlore gazeux glossaire dans le blanchiment des pâtes à papier. La préférence va aujourd’hui au dioxyde de chlore glossaire, peroxyde d’hydrogène glossaire ou à l’ozone glossaire . Toutefois, on retrouve toujours des dérivés chlorés dans le papier, et ce, quel que soit le procédé de blanchiment utilisé. Ils proviennent de la matière première, le bois, ou encore du papier recyclé. Le “papier sans chlore” n’existe donc pas.  

Tu as essayé la prière ?

 
sa marchera pas, je pense que le microcon retien aussi les inhibiteur, il laisse passé que les molécule avec un pm <100

Faudrait voir s'il ne reste pas de polyphénols dans ton papier, certains sont inhibiteurs d'enzymes...Alors peut-être que la lignine aussi...

ouai pe, car on avais essayé avec le phénol chloroforme avant et la c'etait encore pire...je note merci

En fait, les polyphénols sont justement un moyen de défense qu'ont les végétaux pour neutraliser les protéinases des insectes et autres bouffeurs de plante (nous, inclus) en se fixant sur leurs enzymes...

faut voir si mnt le papier traité contient ces polyphénols ! jvais regarder sa dans la litérature
 
édit : on a fait la manip avec de l'adn extrait pur donc l'effet inhibiteur des polyphénol sur la P-K n'as pa s lieu d'etre puisque aucune cellule n'a été lysé ! on a utilisé la P-K seulment pour suivre le protocule et pour ce donné une idée quand on utilisera les empreinte palmaire...    
 
je seche vraiment la

Il me semble que les polyphénols sont aussi capables de se fixer sur l'ADN...
T'étais dans quelles conditions: pH, température et force ionique?

 
de quelle maniere détruit il les bactéries ? ainssi que les virus ? influence sur l'adn ??

Les polyphenoles ne passent pas l'étape de phénol:chlo en toute logique, et la P-K non plus d'ailleurs.  
 
Y'a quoi dans la solution chelex ?
 
Paske si c'est un chelateur pour inhiber les DNAses, elle risque pas de marcher la Taq    
 
Communique-nous ton protocole en entier, dis-nous exactement ce que tu fais...

 
T° pour la P-K c 56° pendant 15 minute puis on la détruit a 100° pendant 8 minute sinon le reste du temp c'etait la temp du labo
 
Ph je c pas
 
force ionique, le chelex a 2 extrémité négatif, il retient l'adn donc je pense qu'elle doit etre forte mais impossble que je te la quantifie comme sa :s

 
 
on a pas utilisé d'etape phénol chlo direct passé a un mix de chelex et de  p-k
 
pour le protocole, c'est un bete protocole d'extraction d'adn au chelex
 
pour la solution chelex j'en sait rien c'est pas moi qui la prépare mais a mon avis c'est 95% d'H2Od et 5% de billes  

 
Oui, mais c'est surement pas l'actualité de 2006, ça date quasiment du siècle précédent  

Ah bah, en fait c'etait pas la Taq le probleme    
 
Je prefere pas reveler l'origine du probleme, c'est un peu trop la honte  

Renversé ton whisky dans la polymérase ?

 
Nan    
 

Dis nous dis nous!
 
(Je suis très friand de ces petites humiliations de labo, ça me fait me sentir moins seul...   )

 
Bah je m'a trompe de bouteille d'agarose, j'ai utilise une vieille bouteille de plusieurs mois et c'est la migration qui foirait (=smear)  
 
J'ai tout change (buffer, dNTP, MgCl2) j'ai meme rachete une autre Taq d'une compagnie differente.... j'en etait a suspecter un attentat du type DNAse dans mes tubes  

Ah ouais la tuile toute conne...
A noter que quelle que soit l'erreur produite, elle est TOUJOURS beaucoup plus stupide qu'on ne le pense...

 
Et elle est surtout reproductible    
 
J'ai fait 4 gels avant de m'en rendre compte.

Les joies du labo...

OMG on dirait une page sortie toute droit de la Wayback Machine

Une fois je sais pas ce qui m'a pris, il devait être tard, ma grand mère était morte    , mon chien s'était fait écrasé... j'ai fait un gel à l'eau distillée.
T'm'étonnes que mes bandes étaient pales.
 
La honte...

 
C'est le genre de truc que tu mets pas dans ton cahier de manip'  

En fait je m'en suis rendu compte pendant la migration... =>
Je me suis revu en train de remplir mon éprouvette au jerrican de flotte au lieu de celui du tampon.
indignation en tropis temps:

Puis
Puis
Et comme il restait peu de temps, j'ai laché l'affaire et je l'ai refais le lendemain...

 
T'avais qd mm la solution de calculer le volume et de soupoudrer avec les sels qui vont bien

Pendant qu'on est dans les manips qui foirent à cause d'étourderies:
Un stagiaire me demande mon avis car il n'observe que des pics minuscules en chromato liquide. Recalcul de concentrations d'échantillons utilisés, inspection de la colonne, 36000 hypothèses...et là, je vois qu'il n'avait pas connecté la colonne à l'injecteur...

J'avoue que ça m'a fait rigoler...
 

http://www.phdcomics.com/comics.php

Aïe! Et tu avais passé beaucoup de temps sur les étapes de purif précédentes?

 
Nan, heureusement c'est une purif que j'avais déjà optimisé, j'ai perdu une journée seulement. Dans le même genre, sur une échangeuse d'ions, j'ai confondu deux tubes et au lieu d'éluer ma protéine au NaCl, je l'ai éluée au SDS 10%    
 
Mais pour une purif que j'ai du faire 100 fois, le taux de plantage reste raisonnable. Je n'ai jamais fait de "petite" erreur : quand je me plante, je le fais franchement, au moins ça t'évite de te demander si tu essaies de sauver la purif où si tu laisses tomber  

Le problème c'est que voyant que ça marchait pas, j'ai stocké le gel au frigo (dans de la celophane)...
Alors avec l'évaporation etc, laisse tomber.
Sans compter que rajouter les sels dans la cuve de migration, ça change tout le bignou pendant que le courant passe... je le sens moyen ton truc.

Un stagiaire boulet qui passait après moi au harvester pour récupérer ses cellules nourrient à la thymidine tritiée, a oublié de mettre un filtre. Paye ton flan...
 

Sinon pour continuer dans la serie "grosse tuile", je suis tombe une fois sur un stock d'eppendorf de mauvaise qualite...
 
Une journee de manip' (IP d'une prot', kinase assay etc) et derniere etape pour laver le bazar (chaud au P32 of course), je lance la centri plein pot, tout le materiel est passe "au travers" du do fond des tubes   , la manip ==> dans la centri    
Paye ton lavage avec les P32 et tout...  

Comment t'as fait d'ailleurs?