1.2)Dosage des PSP dans les mollusques bivalves.
 
La méthode standardisée est utilisée dans de nombreux pays du monde. Elle est considérée comme la méthode biologique de référence pour la détection des toxines paralysantes. C?est une méthode fiable qui donne des résultats comparables car elle comprend le calcul d?un coefficient de correction qui tient compte des conditions propres à chaque laboratoire.
 
lourd
 
1.2.1) Domaine d?application.
 
Cette méthode permet de déterminer la teneur globale en phycotoxines paralysantes d?un extrait de chair totale de coquillages. Elle ne permet pas de quantifier individuellement chaque toxine.
 
La toxicité est exprimée en µg d?équivalent-saxitoxine (µg équiv.-STX) pour 100g de chair. 1µg équiv.-STX est la quantité pondérale ou molaire de chaque toxine équivalente à la toxicité de 1µg de saxitoxine. Cette unité tient compte de l?activité biologique propre à chaque phycotoxine paralysante, dite « toxicité spécifique ».
 
La limite de détection de la méthode est d?environ 40µg équiv.-STX pour 100g de chair de coquillages et le coefficient de variation est de 15 à 40%.
 
1.2.2) Principe de la méthode.
 
Le test biologique sur souris consiste en l?injection intrapéritonéale, à des souris de 20 grammes, d?un extrait acide de l?échantillon. Le temps écoulé entre la fin de l?injection et la mort de la souris est mesuré précisément, on définit ainsi un temps de survie.
 
Cetemps de survie est ensuite exprimé en Unités-souris à l?aide de la table de Sommer. Une Unité-Souris est définie comme la quantité de toxine qui, injectée par cette voie, tue une souris de 20g en 15 minutes. Les Unités-souris sont converties en µg équiv.-STX à l?aide d?un Facteur de Conversion (FC) mesuré lors de l?étape préliminaire de standardisation du test. Les valeurs du FC peuvent varier de manière importante avec les conditions opératoires : chaque laboratoire doit établir annuellement son FC.  
 
1.2.3) Protocole.
 
Il est nécessaire de recueillir 100 à 150g de chair consommable rincée et égouttée, en faisant attention de ne pas abîmer le corps du mollusque si celui ci est habituellement consommé entier. La chair est broyée jusqu?à homogénéité.
 
On pèse exactement 100g de broyat dans un bécher et on ajoute 100ml d?acide chlorhydrique 0.1N. Si on ne dispose pas de 100g de broyat on ajoute n mL de HCL à n grammes de broyat puis on complète à 100mL avec de l?eau après chauffage. Le pH après homogénéisation doit être d?environ 3, à ajuster si nécessaire (goutte à goutte avec HCL 5N ou NaOH 0.1N).
 
Le bécher couvert d?un papier aluminium est porté à ébullition douce sous agitation pendant 5minutes. L?extrait refroidi doit toujours avoir un pH de 3. Il est transvasé dans une éprouvette complétée à 200mL avec de l?eau. L?ensemble est décanté jusqu?à apparition d?un surnageant clair ou centrifugé (15min. à 3000tpm). Le surnageant prélevé est prêt pour injection, il peut être conservé à 4°c.
 
1.2.4) Calcul de la toxicité.
 
Les souris sont pesées avant l?injection.
Il faut injecter d?abord l?extrait à 2 souris pour une détermination initial : 1mL d?extrait acide par voie intrapéritonéale et par souris. Le temps de survie doit être noté précisément, la mort étant déterminé par le dernier souffle.
 
Les symptômes typiques d?intoxication paralytique chez la souris sont les suivants :
-Les premiers signes d?intoxication sont des paresthésies faciales, les souris se grattent le museau avec les pattes avant.
-Les souris sont ensuite prises de soubresauts et autres mouvements brusques et désordonnés dont l?intensité croit progressivement.
-Les animaux se couchent ensuite sur le côté en suffoquant, puis meurent par asphyxie due au blocage respiratoire.
 
Un comportement ou des symptômes différents doivent être notés. Si le temps de survie obtenu avec cet extrait est supérieur à 5 minutes, il faut inoculer une autre souris (total de 3 souris) pour établir la toxicité de l?échantillon. Le temps d?observation maximal est de 1 heure.
Si le temps de survie moyen des 2 souris est inférieur à 5 minutes, il faut réaliser des dilutions (avec pH ajusté) jusqu?à obtenir un temps de survie compris entre 5 et 7 minutes.
 
Pour des souris pesant entre 19 et 21 grammes : Il convient de calculer le temps de survie médian en tenant compte des survivantes (exemple : 7 minutes pour des temps de 6/6/7/12/14 minutes). Ce temps sera converti en Unités-Souris à l?aide de la table de Sommer. Exemple de calcul : temps de survie 6, 7 et 14 minutes => temps de survie médian 7 minutes => 1.39 Unité-Souris.
 
Pour des souris pesant moins de 19grammes ou plus de 21grammes : il est nécessaire d?appliquer une correction pour chaque souris. Le temps de survie de chaque souris et converti en Unités-souris et multiplié par le Facteur de Correction Pondérale FCP. On détermine ensuite la valeur médiane des Unités-Souris pour le groupe. Exemple de calcul :
 
-1ère souris, temps de survie 6 min => valeur US=1.6,
poids 22g => FCP=1.05, valeur retenue=1.68
-2ème souris, temps de survie 7 min => valeur US=1.39,
poids 18g => FCP=0.93, valeur retenue=1.2927
-3ème souris, temps de survie 14 min => valeur US=1.015,
poids 23g => FCP=1.07, valeur retenue=1.086
Valeur médiane en Unités-Souris=1.2927
 
La valeur médiane des US est convertie en µg d?équivalent-saxitoxine par mL en multipliant le nombre d?US par le Facteur de Conversion FC. Le nombre de µg d?équivalent-saxitoxine pour 100g de chair est égal au nombre de µg par mL, multiplié par le facteur de dilution (s?il y a lieu) et par 200 :
PSP =  US * FC * facteur de dilution * 200
 
La chair est considérée comme impropre à la consommation si cette valeur finale est supérieure à 80µg équiv.-STX.100g-1.