Ensuite, si c'est pour un poster, c'est mL pour millilitre, pas ml

1)Détection des phycotoxines diarrhéiques (DSP) et paralysantes (PSP) par méthodes biologiques sur souris.
 
L?IFREMER utilise dans le cadre du REPHY des méthodes de détection des toxines par les tests sur souris. Les DSP sont détectées sur des extraits de glandes digestives, les PSP sont recherchées dans la chair totale des coquillages. La méthode de dosage des toxines DSP est une méthode non standardisée dont le seuil de risque a été adapté pour le REPHY. La méthode de dosage des toxines PSP est adaptée d?une méthode standardisée de l?AOAC (www.aoac.org), considérée comme la méthode biologique de réference pour les toxines PSP.
 
 
1.1)Dosage des DSP dans les mollusques bivalves.
 
Le test initialement décrit par YASUMOTO et al. (1978) a été simplifié afin de le rendre utilisable en routine dans le cadre d?un réseau de surveillance :
-Détermination d?un seuil de risque potentiel pour le consommateur grâce au calibrage par un test sur souriceau (YASUMOTO 1980). Le seuil de 5 heures a servi jusqu?à présent de référence réglementaire pour l?élaboration des mesures d?interdiction de commercialisation et de ramassage des coquillages en France. Le seuil de détection, estimé équivalent à un temps de survie moyen des souris égal à 24 heures, détermine une marge de sécurité importante.
-Rapidité de la réponse, le seuil de risque de 5 heures permet l?obtention de résultats dans la journée.
-Simplicité de mise en ?uvre.
-Coût acceptable en investissement et en fonctionnement.
-Sensibilité acceptable.
 
La méthode classique utilise une extraction par l?acétone. La découverte en 1992 de toxines atypiques interférant avec le test a amené une modification de la procédure. L?extraction par l?acétone donne une réponse en termes de toxicité globale avec des toxines qui ne sont pas des toxines DSP.
La nouvelle version du test recourt à une extraction méthanol/hexane/dichlorométhane, elle est spécifique des toxines diarrhéiques et peut-être considérée comme une méthode de dosage des DSP.  
Les méthodes et les normes sont différentes d?un pays européen à l?autre et il sera nécessaire à terme de les harmoniser afin d?offrir à tous les consommateurs le même niveau de sûreté.  
 
1.1.1)Intérêts de la méthode.
 
Cette méthode permet de déterminer la teneur globale en phycotoxines diarrhéiques d?un extrait de glandes digestives de coquillages. Elle ne permet pas de quantifier individuellement chaque toxine.
La toxicité est exprimée d?une façon indirecte par la moyenne des temps de survie de trois souris. La limite de détection correspond à un temps de survie de 24 heures.
La méthode validée par l?IFREMER est exclusivement celle recourrant à une extraction méthanol/hexane/dichlorométhane.
 
 
 
 
 
1.1.2)Protocole d?extraction.
 
Le test biologique sur souris consiste en l?injection intrapéritonéale, à des souris de 20grammes, d?un extrait de l?échantillon par le dichlorométhane, repris dans le tween. Le temps écoulé entre la fin de l?injection et la mort de la souris est mesuré : c?est le « temps de survie ». Le temps de survie moyen est calculé selon les règles précises mentionnées en 1.1.3.
 
La préparation des échantillons doit être méticuleuse. Les coquillages nettoyés et ouverts, on rince l?intérieur à l?eau courante pour éliminer le sable et les corps étrangers. Les glandes digestives  sont prélevées et égouttées. L?extraction se fait sur 20g de glande pesés au cg près et broyés à l?ultratrax. Un surplus (2*5g) est gardé pour une éventuelle analyse en CLHP. Ensuite 3 extractions sont pratiqués :
 
-Une extraction dans une solution méthanol/eau 80/20 (2*60mL)
-Une extraction liquide-liquide sur le surnageant (hexane 2*60mL). La phase aqueuse (120mL de méthanol/eau) est portée à 140mL par ajout d?eau.
-Une extraction liquide-liquide avec du dichlorométhane (2*80mL)
 
La phase dichlorométhane contient les produits moyennement polaires, en particulier les toxines DSP. Les produits apolaires (par exemple les acides gras) sont éliminés dans la phase hexane. Les produits de forte polarité (par exemple certaines toxines atypiques) sont éliminés dans la phase aqueuse méthanol/eau. Cette dernière phase est conservée au réfrigérateur jusqu?à la fin du test pour analyse éventuelle en cas de comportement anormal des souris (présence de toxines atypiques dans la phase dichlorométhane).
 
La phase dichlorométhane est évaporée au rotovapor entre 30 et 40°c (ne pas dépasser 40°c car les toxines sont thermosensibles). Le résidu doit être repris et dissous dans 4mL de tween60 à 1% pour obtenir l?extrait prêt pour l?injection.
 
1.1.3)Calcul de la toxicité.
 
On injecte 1mL de l?extrait à chacune des 3 souris par voie intrapéritonéale. Les 4mL représentant 20g de glande digestive, 1mL correspond à 5g de glande. On note précisément l?heure d?injection qui marque le début de 24heures d?observation. En cas de mort pendant la nuit, on considère que la souris est morte à la moitié de la période de non-observation.
 
Le temps de survie moyen est calculé selon les règles suivantes :
-Mort des 3 souris : moyenne arithmétique des 3 temps de survie.
-Mort de 2 souris : moyenne sur les 2 souris mortes (la souris survivante est considérée comme un résultat aberrant).
-Mort d?1 souris : La moyenne est considérée comme supérieure à 24 heures (la mort d?une souris  est considérée comme un résultat aberrant).
 
Un temps de survie moyen égal ou supérieur à 5 heures correspond à une concentration en toxines dangereuse pour le consommateur. Un temps de survie moyen compris entre 5 et 24 heures correspond à une concentration en toxines suffisamment faible pour ne pas intoxiquer les consommateurs. Un temps de survie moyen supérieur à 24 heures correspond à une concentration en toxines nulle ou inférieure au seuil de détection.
 
Dans le cas d?une extraction acétonique une survie proche de 24 heures correspond à une Unité Souris, soit 4µg d?acide okadaïque (AO) (YASUMOTO et al., 1978) pour 5g de glande digestive ou encore 0.8µg d?AO par gramme de glande digestive. Pour un temps de survie compris entre 5 et 24 heures, on considère que l?échantillon peut contenir jusqu?à 1.6 µg d?AO par gramme de glande digestive (on réalise une injection avec une dilution au demi et les souris survivent ou meurent autour de 24 heures). Au niveau européen, on considère que le seuil de toxicité se situe à 0.8µg par gramme de glande, donc que les échantillons amenant à une survie comprise entre 5 et 24 heures proviennent de coquillages impropres à la consommation.
 
L?extraction au dichlorométhane aboutit à des morts plus rapides et correspond donc à une meilleure concentration des toxines. On considère qu?un temps moyen de survie compris entre 5 et 24h correspond à une concentration certainement inférieure à 1.6µg d?AO par gramme de glande digestive.  
 
La marge de sécurité vis-à-vis des consommateurs de coquillages est donc plus grande avec l?extraction méthanol/hexane/dichlorométhane, puisque le test est plus sévère. En outre, cette méthode élimine les faux positifs dus aux acides gras libres (toxiques par injection sur la souris). Il reste cependant à quantifier la concentration d?AO présente dans les coquillages quand le temps de survie est compris entre 5 et 24 heures, c?est-à-dire quand les coquillages ne sont pas encore interdits à la vente.