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2)Détection des toxines amnésiantes (ASP) par méthode CLHP.
 
Dans le cadre du réseau de surveillance français en matière de toxines amnésiantes, l?acide domoïque a été détecté pour la première fois dans des échantillons de coquillages. Le dosage de l?acide domoïque (AD) par Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à un détecteur Ultra Violet (UV), dans la partie comestible des bivalves, est effectuée dès que le seuil de 105 cellules par litre de diatomées du genre Pseudo-nitzchia spp. est dépassé. La CLHP/UV constitue la méthode officielle.
 
Les analyses réalisées pendant l?année 1999 ont révélé la présence de l?acide domoïque dans des bivalves prélevés en différents points des côtes françaises. Toutefois, la quantité maximale de toxine trouvée ne dépassait pas 3.2µg d?AD par gramme de chair totale de coquillages, ce qui est largement en dessous du seuil sanitaire autorisé (20µg AD/g de chair). Des cultures de P. multiseries ont confirmé sa toxicité et son implication dans l?accumulation de l?acide domoïque dans les bivalves en France.
 
La directive européenne 97/61/CE du 20/10/1997 est appliquée par le REPHY depuis 1999. Elle ajoute le dépistage des ASP à ceux des DSP et PSP dans les coquillages. Si pour les DSP et PSP l?utilisation de tests biologiques sur souris est adaptée aux exigences de la législation, il n?en est pas de même pour les toxines amnésiantes ASP. En effet la législation fixe une limite à 20µg AD/g de chair, inférieure au seuil de détection des techniques sur souris (40µg AD/g de chair).
 
2.1)Mode opératoire.
 
2.1.1) Préparation des échantillons.
 
La chair totale de coquillages est récupérée et broyée (100grammes, ultra-turrax 8000tpm). Une prise d?essai de 4g est homogénéisée dans 16mL de MeOH/H20 1:1 (ultra-turrax 10 000tpm 3min.) et centrifugée (4000tpm 10min.). 10mL de surnageant sont filtrés (0.2µm).
 
Parallèlement à cette préparation de chair totale, une préparation identique est réalisée sur des hépatopancréas (30g). Une 3ème préparation est effectuée à partir d?un homogénat certifié de moules contaminées (MUS-1B).
 
Une dernière préparation est réalisée. Il s?agit de constater la toxicité d?algues Pseudo-nitzschia isolées lors des efflorescences et mises en culture. Les cellules algales sont éclatés par sonication (5min.) et centrifugées à 4000tpm pendant 15minutes. Le surnageant est filtré sur 0.2µm pour analyse CLHP/UV.
 
2.1.2)Détermination des paramètres chromatographiques.
 
Il a été nécessaire de déterminer le maximum d?absorption de l?acide domoïque ainsi que les autres paramètres de la CLHP. Ces paramètres doivent être choisis de façon à optimiser la reproductibilité du temps de rétention de l?AD, la linéarité de l?injecteur automatique et la répétabilité de la méthode.
 
Un balayage des longueurs d?onde, réalisé à l?aide du détecteur à barrette de diodes, permet la détermination du maximum d?absorption d?une molécule donnée. Pour l?acide domoïque, cette longueur d?onde à été mesurée à l=242nm pour l?acide domoïque.
 
Les 3 paramètres de la chromatographie sont la température, le débit et la composition du solvant d?élution. Leur optimisation est réalisée à partir de solutions étalon d?acide domoïque et d?échantillons contaminés certifiés (mesure de l?effet matrice).
 
Les températures de 22.5°c, 30°c, 40°c et 50°c ont été testées, avec un débit constant de 1mL/min et un solvant H2O 0.1%, Acide Trifluoroacétique (TFA)/Acétonitrile 90:10. La température de 40°c a été retenue pour les analyses. A 40°c la résolution est bonne et le temps de rétention (TR) et d?environ 12 min.
 
A la température retenue, différents débits ont été testés : 0.8/1.0/1.2 mL/min, avec le même mélange solvant. Le débit de 0.8mL/min n?est pas satisfaisant car le TR obtenu est long (13.7min). Pour trancher entre les 2 autres débits, il faut tester différents mélanges solvants.
 
Les différents mélanges-solvant testés sont les suivants : 92:8 , 90:10 , 89:11 , 88:12, appliqués aux débits de 1mL/min puis 1.2mL/min. Après comparaison des chromatogrammes du standard et des extraits de moules, il apparaît que la meilleure résolution est obtenue pour un mélange 90:10 à 1mL/min.
 
La colonne utilisée mesure 4.6mm x 250mm, avec une phase stationnaire de silice greffée C18, elle est placée dans un four thermostaté à 40°c. Le volume maximal injecté sera de 40µl. La longueur d?onde du détecteur sera de 242nm. Le temps d?analyse maximal est fixé à 15min. L?AD des extraits sera quantifiée par une méthode d?étalonnage externe.
 
2.2)Mode de calcul de la concentration d?AD.
 
Pour déterminer la concentration de l?acide domoïque dans les échantillons, une gamme de solution standard est préparée et injectée dans les mêmes conditions. De plus, au cours de l?analyse des échantillons, un standard est injecté afin de suivre en éventuelle fluctuation du temps de rétention de l?acide domoïque due à l?effet matrice.
 
 La quantité d?acide domoïque (en µg AD/g de chair), dans chaque échantillon, se calcule selon la formule suivante :
[AD] (µg/g) = (AS/AC) x (Cs/p) x F
 
-As = moyenne des surfaces du pic d?acide domoïque dans l?échantillon injecté en double.
-Ac = moyenne des surfaces du pic d?acide domoïque du standard proche de celle de l?échantillon.
-Cs = concentration du standard (en µg/mL) proche de celle de l?échantillon.
-p = masse de la prise d?essai (environ 4g)
-F = facteur de dilution (F=20 ici)