3)Développement de méthodes alternatives.
 
L?évolution des mentalités concernant la protection des animaux de laboratoire ainsi que la nécessité d?obtention de résultats fiables et reproductibles en un minimum de temps ont amené les équipes de l?IFREMER à réfléchir à de nouvelles méthodes de détection.
Dans une fiche documentaire de février 1996 l?institut publie une nouvelle méthode basée sur un test de cytodétection des phycotoxynes diarrhéiques désignée par l?acronyme DRAME pour Détection Rapide de l?Acide okadaïque dans les Moules après Extraction. La base de ce test repose sur l?observation de modifications de la morphologie de certaines cellules sous l?effet de toxines de type acide okadaïque. Ces modifications sont induites par le blocage des protéines-phosphatases qui entraîne une phosphorylation des protéines du cytosquelette.
L?étude aboutit à des conclusions positives quant à la spécificité, la sensibilité et la rapidité de la méthode. La corrélation avec les méthodes de CLHP est également démontrée.
 
 
 
 
3.1)intérêts de la méthode.
 
Depuis 1983, le REPHY surveille la qualité sanitaire des coquillages de consommation par la « méthode souris ». Le principal intérêt de cette méthode est sa rapidité. Une méthode alternative doit pouvoir être exécutée en routine avec une réactivité comparable. La mise au point de la méthode DRAME a donc été entreprise dans l?optique d?obtenir une méthode spécifique, sensible, rapide et de moindre coût.
Le principe est le suivant : estimer l?activité en recherchant la concentration minimale d?extrait nécessaire pour induire des changements visibles en microscopie optique sur une culture de cellules KB. La lignée cellulaire KB choisie pour effectuer ce test est une lignée de cellules de carcinome humain du rhinopharynx prélevées en 1954. Ces cellules sont appelées KB en référence aux initiales de la patientes donneuse. Les cellules KB poussent in vitro en formant une monocouche adhérente. Le repiquage et le comptage des cellules nécessitent une méthode de remise en solution. On utilise pour cela l?action de la trypsine pendant un moment très court. Le comptage est réalisé au microscope par une coloration simple au bleu de trypan.
 
 
 
 
3.2)Etude préliminaire de la cinétique de l?action de l?acide okadaïque sur les cellules KB.
 
Une cinétique de croissance des cellules en présence de différentes concentrations d?AO a été menée afin de déterminer des courbes de croissance en fonction de la concentration en AO et du temps (figure1) .
Cette expérience montre que le témoin croit régulièrement en fonction du temps et que de ce fait la culture est bien en phase exponentielle de croissance. L?activité cytotoxique nette (diminution du nombre de cellules vivantes) est parfaitement visualisée. Elle apparaît d?autant plus tard que la concentration testée est faible.
La CI50 (concentration inhibant 50% de la croissance) de l?acide okadaïque apparaît faible (3ng/ml), prouvant la grande sensibilité de la méthode. Mais le temps d?observation nécessaire pour son observation est très long (72h) ! Cette durée est incompatible avec une utilisation en contrôle de routine. Par contre les changements de morphologie apparaissent eux en quelques heures et permettent la mise au point d?une technique de détection biologique de l?AO.
 
                   
 
3.3)Développement de la méthode.
 
Le point crucial est le mode de lecture de résultats. Les tests colorimétriques ne permettant pas l?obtention d?une valeur chiffrée -obligatoire pour estimer le taux de contamination des coquillages-, il a fallu développer une méthode originale dans le domaine des tests sur cultures cellulaires : la détermination de la Concentration Minimale Active (CMA) c?est à dire la concentration minimale qui induit un changement de la morphologie des cellules.
 
Pour déterminer la CMA il faut établir une gamme géométrique de dilutions (4 à 64µg/ml) d?extraits de coquillages à mettre en contact avec les cellules. L?extrait est obtenu à partir de l?hépatopancréas du coquillage par une série de partages liquide-liquide dans différents solvants. L?extrait final est évaporé à sec et pesé, il sert à la réalisation d?une solution mère à diluer.
 
Les cellules sont déposées la veille du test dans les puits d?une plaque de microtitration (12 colonnes *  8 rangées = 96puits). On utilise une culture cellulaire en phase exponentielle de croissance et contenant 200 000 cellules par ml. La plaque est stockée dans un incubateur à CO2 à 37°c jusqu?au moment du test. Le dépôt est de 50µl de suspension dans les puits testés et 100µl dans les témoins (pour obtenir la même concentration finale. Lors de l?incorporation, 50µl de chacune des solutions de la gamme sont ajoutés aux 50µl de suspension cellulaire. La dilution induite doit être compensée en préparant une gamme de 8 à 128µg/ml et non 4 à 64µg/ml.
 
Le plan de plaque est le suivant : 1 colonne= 1 extrait, 1 ligne = 1 concentration. Chaque extrait est testé en double.
 
La détermination de la CMA se fait par lecture directe de la morphologie des cellules en culture au microscope sans coloration préalable. En effet il existe une grande différence morphologique entre les cellules témoins et les cellules traitées avec un extrait toxique. Dans l?état normal, les cellules KB présentent un aspect épithélial avec des espaces intercellulaires. Les cellules ayant subit l?action de la toxine s?arrondissent.  
 
Les deux types morphologiques coexistent aux faibles concentrations en toxine. On regarde les puits en commençant aux faibles concentrations et on considère la première cupule dont l?aspect diffère nettement du témoin par la présence d?au moins 30% de cellules rondes. Cette méthode est moins aléatoire qu?il n?y parait puisque des personnes indépendantes ont obtenu les mêmes résultats (à 100%) sans concertation.
 
La CMA lue est exprimée en poids d?extrait par ml de culture. Il faut retravailler ce chiffre en tenant compte du rendement d?extraction c?est a dire multiplier la valeur lue par le poids d?hépatopancréas divisé par le poids extrait.
 
Pour compléter ce protocole il a été nécessaire de standardiser la durée d?incubation entre les dépôts et la lecture. Des lectures ont été réalisées chaque heure entre 2 et 8 heures amenant à la conclusion qu?il existe un plateau entre 3 et 4 heures. C?est la durée optimale d?incubation retenue.